《Bio-des. Manuf.》:3D活体生物打印技术研究进展!

 转载   原创2023-01-13 00:02·EngineeringForLife

生物打印在组织工程和再生医学方面已广泛应用。但是由于传统生物打印技术(如挤压和喷墨打印)分辨率有限,很难重建复杂细胞排列。近日,来自西安交通大学的贺健康教授团队进行了功能化基于藻酸盐生物墨水用于活体组织结构微型电流体动力生物打印改善细胞扩散和排列的相关研究。相关研究成果以“Functionalized alginate-based bioinks for microscale electrohydrodynamic bioprinting of living tissue constructs with improved cellular spreading and alignment”为题于2022年12月24日发表在《Bio-des. Manuf.》上。

 

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图1 结构及流程示意图

 

本文开发了一种电流体动力(EHD)生物打印策略,用于精确沉积组织良好细胞构建物,具有微尺度长丝尺寸,致力于开发应用于EHD生物打印并同时支持细胞扩散的生物汇。功能化海藻酸基生物汇,使用接枝和纤维蛋白结合微尺度EHD生物打印,实现细胞活力(>90%)和细胞扩散。加入聚氧乙烯,打印出的细丝可以进一步细化到30um,暴露于水环境中保持稳定超过一周。利用海藻酸基生物汇可以观察到在EHD打印的微尺度细丝内沿打印支管特定层细胞排列,可实现制造具有细胞尺度细丝分辨率的活体结构,引导细胞定向生长。

 

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图2 功能化海藻糖基生物墨水微尺度电动水动力生物打印活体组织构建示意图

 

为制造微尺度水凝胶纤维,墨水装入1mm的注射器,由注射器泵控制。打印喷嘴固定在Z轴上,与高压发生器正极连接。绝缘培养皿和含有钙离子琼脂糖水凝胶依次放在接地X-Y移动平台作为收集基底。打印油墨中海藻酸与由钙离子组成琼脂糖水凝胶接触后立即交联,形成水凝胶丝并沉积在收集基底上。水凝胶细丝沉积可以灵活控制,根据用户具体设计,通过指导X-Y平台运动来制造复杂的图案。逐层方式制造出具有特定层方向的多层结构。每一层中,水凝胶微纤维打印和堆叠形成平行的微墙,墙的间距保持在250um。五层水凝胶微墙完全打印出来形成生物活性结构。

 

图示

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图3 纯海藻酸盐和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的海藻酸盐相关表征

 

接着验证海藻酸盐上RGD接枝是否成功,评估油墨成分对其流变特性影响。傅立叶变换红外光谱显示海藻酸钠典型吸收带说明RGD被成功连接到藻酸盐链上。NMR镜检用来确认RGD修饰。流变学测试研究各种海藻酸基油墨可印刷性。海藻酸盐粘度随着RGD序列加入而大大增加,可能是RGD肽和海藻酸盐分子链之间交联效应结果。纤维蛋白的结合将进一步增加海藻酸盐和RGD-海藻酸盐的粘度,表明纤维蛋白的加入促进了蛋白质的扩展和聚合物链的相互作用。接着研究生物汇的生物相容性,四组生物汇包裹C2C12细胞挤压生物打印技术,形成10层细胞填充结构。细胞活/死染色图像显示:所有结构中细胞保持高活性,但是纯海藻酸盐结构中的大多数细胞没有扩散,显示出球状形态。胞的伸展性通过RGD修饰或纤维蛋白掺入得到明显改善。CCK-8实验结果显示RGD-ALG/FIB墨水可以保持最高的细胞活力。

 

图示, 工程绘图

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图4 进料速度和平台移动速度对电流体力学印刷的长丝宽度的影响

 

对打印工艺参数进行优化结果显示,EHD打印纤维的宽度可以通过调节油墨进料速度和基底的移动速度来调节。较慢的溶液进给速度和较高的打印台移动速度会产生较薄的纤维。为了进一步提高打印精度,PEO加入油墨,PEO的添加有望防止液滴形成,从而形成一个稳定的喷射。结果显示通过简单在墨水溶液中加入PEO,可以打印精确图案,精确控制逐层纳米纤维的沉积,添加PEO可以降低油墨的表面张力,在EHD打印过程中,作用于液体表面的电应力克服表面张力,使液体半月板形成泰勒锥体,从而喷出薄薄的油墨。因此,降低油墨的表面张力可以帮助泰勒锥的形成,从而有效减少印刷线的宽度,促进高分辨率3D打印。

 

背景图案

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图5 RGD-ALG/FIB/PEO生物墨水制成的5层EHD生物印刷活体构建体细胞实验。

 

为更好模仿具有复杂几何形状天然ECM和细胞特定层方向,研究人员设计了具有更复杂几何形状的"细胞负载 "结构,使用开发的生物墨水进行EHD打印。由于EHD生物打印策略的精确图案化能力,可以获得充满细胞的复杂六边形孔隙结构。多角度打印的细丝可以准确沉积并清晰可见。此外,EHD打印的C2C12s可以保持高生存能力以及结构定向排列。细胞在打印过程中倾向于平行于应变方向排列,以达到最大有效刚度。低剪切应力不会决定细胞的生长方向,因此,细胞通过在细丝内凝结而打印,在几何线的引导下扩散,细纤维结构引导细胞的定向生长。

 

总之,本文开发了一种功能化海藻酸盐基生物墨水,用于微尺度电流体动力生物打印活体组织构建,改善了细胞扩散和排列。通过用RGD肽对海藻酸盐功能化,并加入纤维蛋白和PEO,在EHD生物打印细胞填充支架中,从培养第一天起可以观察到C2C12优良生存和扩散能力。PEO的加入可以通过减少载细胞纤维尺寸来显著提高打印精度,而不会破坏支架稳定性和生物相容性。多层结构角度变化打印后,根据打印微纤维显示出高度细胞定向性。新型功能化水凝胶生物墨水和EHD工艺突出特点将促进研究人员设计出具有更佳物理和生物特性的微结构支架,更好模拟自然界中复杂的细胞微环境。

 

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